闡述pcr核酸檢測試劑盒建立的理論模式和工作原理

　　1、什么是定量PCR？

　　以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過程進(jìn)行監(jiān)測，從而達(dá)到評估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR擴增的指數(shù)期進(jìn)行的。

　　2、定量PCR定量的理論依據(jù)是什么？

　　特定的待擴增基因片段起始含量越大，則指數(shù)擴增過程越短，當(dāng)擴增速率趨于穩(wěn)定后，則無論原來樣品中起始模板含量多少，終擴增片段的含量通常是一樣的。

　　理想的擴增結(jié)果：Y=X×2n其中Y代表擴增產(chǎn)物量，X代表PCR反應(yīng)體中的原始模板數(shù)n為擴增次數(shù)；理論上PCR擴增效率為*，PCR產(chǎn)物隨著循環(huán)的進(jìn)行成指數(shù)增長，但實際上：DNA的每一次復(fù)制都不*，即每一次擴增中，模板不是呈2的倍增長；實際應(yīng)為：Y=X(1+E)n，其中E代表擴增效率：E=參與復(fù)制的模板/總模板，通常E≤1，E在整個PCR擴增過程中不是固定不變的。通常X在1～105拷貝、循環(huán)次數(shù)n≤30時，E相對穩(wěn)定，原始模板以相對固定的指數(shù)形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數(shù)期；隨著循環(huán)次數(shù)n的增加（>30次），E值逐漸減少，Y呈非固定的指數(shù)形式增加，后進(jìn)入平臺期。

　　3、熒光定量PCR定量的理論模式又是什么？

　　PCR是對原始待測模板核酸的一個擴增過程，任何干擾PCR指數(shù)擴增的因素都會影響擴增產(chǎn)物的量，使得PCR擴增終產(chǎn)物的數(shù)量與原始模板數(shù)量之間沒有一個固定的比例關(guān)系，通過檢測擴增終產(chǎn)物很難對原始模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。近年來研究人員通過大量的實踐，研究了相對準(zhǔn)確的定量PCR方法，即熒光定量PCR。

　　PCR擴增通式：①Tn=T0（1+E）n

　　②Tn=Tn-1（1+E）n注：[0

　　其中E表示擴增效率，n為循環(huán)數(shù)，Tn表示在n個周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量，Tn-1表示在n-1個周期后PCR產(chǎn)物的數(shù)量，T0為原始模板數(shù)量。設(shè)定PCR到達(dá)指數(shù)擴增期時，產(chǎn)生一定的熒光(熒光依賴于某一循環(huán)擴增產(chǎn)物的總量，即特定的拷貝數(shù)K，為常數(shù)，大約在1010左右)高于背景為儀器所識別，此時的循環(huán)數(shù)為CP（crossingpoint）,也就是K=T0（1+E）CP，取對數(shù)即：

　　lgK=lgT0+CP*lg(1+E)

　　CP=-1/lg(1+E)*lgT0+lgk/lg(1+E)

　　pcr核酸檢測試劑盒的成分產(chǎn)品組成：DNA提取液2、CTPCR反應(yīng)液、HS-Taqplus酶、UNG、CT陰性對照、CT臨界陽性對照、CT強陽性對照。產(chǎn)品有效期：貯存于-20℃，有效期12個月。附件：注冊產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品說明書。

　　適應(yīng)癥該產(chǎn)品用于對人尿道、生zhi道分泌物拭子樣本中的沙眼衣原體核酸DNA的檢測

　　PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時,探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。

　　pcr核酸檢測試劑盒的檢驗原理：pcr核酸檢測試劑盒從人血清或血漿中提取丙型肝炎病毒核酸（HCVRNA），通過RT-PCR一步法反應(yīng)，利用特異性引物對HCVRNA進(jìn)行體外擴增，在體系中采用Taqman-MGB探針法并結(jié)合非競爭性內(nèi)標(biāo)技術(shù)來定量檢測人血清或血漿中丙型肝炎病毒核酸（HCVRNA）的數(shù)量。可用于臨床對丙型肝炎的輔助診斷和抗病毒yao物的療效觀察。