在實驗操作過程中，需特別注意以下幾點以確保實驗的準確性和安全性：

1. 抗體保存與解凍
抗體應嚴格保存于-20℃或更低溫度，避免反復凍融。使用時置于冰上緩慢解凍，解凍后輕輕混勻，避免劇烈震蕩導致抗體變性。分裝保存可減少凍融次數，維持抗體活性。

2. 樣本處理規范
細胞或組織樣本需在預冷的PBS中快速清洗，防止目標蛋白降解。裂解液應含足量蛋白酶抑制劑，操作全程保持低溫環境（4℃以下）。離心后取上清需避免吸入沉淀物，確保樣本純度。

3. 抗體稀釋與孵育
根據預實驗確定最佳稀釋比例（建議1:500-1:2000），使用含1% BSA的TBST緩沖液稀釋可降低非特異性結合。孵育時密封覆膜防止蒸發，搖床轉速控制在60rpm以內，避免機械力破壞抗原表位。

4. 對照設置關鍵性
必須設立空白對照（僅二抗）、同型對照（同亞型無關抗體）及陽性對照（已知表達BMP4的細胞系）。建議增加內參（如β-actin）驗證上樣量一致性，異常結果需重復三次以上。

5. 顯色與終止時機
化學發光法檢測時，ECL工作液需現配現用。顯影時間根據信號強度動態調整（通常10-120秒），強信號背景下可縮短曝光時間。酸性終止液加入后10分鐘內完成掃描，避免膜干燥。

6. 廢棄物處理
接觸抗體的槍頭、離心管等按生物危害廢物處理，含抗體廢液需用10%次氯酸鈉溶液浸泡30分鐘后再廢棄。實驗臺面用75%乙醇擦拭消毒，避免交叉污染。